iTRAQ/SILAC/DIGE/蛋白表達純化
產品名称： iTRAQ/SILAC/DIGE/蛋白表達純(chun)化(hua)
英文名称： Western Biotechnology Inc
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更新時間： 2024-10-31T11:50:38
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iTRAQ/SILAC/DIGE/蛋白表達純化
iTRAQ技術服務
定量蛋白質組學技術概述：
1、基於2-DE的染料染(ran)色方法(fa)的定量策略：
考染、銀染、荧光染色。
考然和銀(yin)染的灵(ling)敏度、動態範围、準確性差。
荧(ying)光染色的灵敏度和準確性比较好。
2、基(ji)於(yu)質谱技術的定量策略
3、非標記的定量策略: Spectrum Count，MRM
4、標記定量策略：iTRAQ，iCAT， SILAC
iTRAQ標記定量技術原理
iTRAQ試剂為可(ke)與氨基酸N端及赖氨酸侧鏈连(lian)接的胺標記同重元素(isobaric)。在(zai)質谱圖中，任郭(guo)一種iTRAQ試剂標記的不同樣本中的同一蛋白質表現(xian)為相同的質(zhi)荷比。
在串聯質(zhi)谱中(zhong)，信(xin)號离子表現為不同質荷(he)比(114～117)的峰(feng)，因此，根據波(bo)峰的高度及面积，可以得到(dao)蛋白質的定量信息。
iTRAQ標記定量技(ji)術實驗流程(cheng)：
樣(yang)品→酶解→標記→混合→質谱→数據(ju)分析
iTRAQ標記定量技術樣品製備
☆需要蛋白量：每個樣品至少100ug
☆全蛋白：直接加入裂(lie)解液(ye)匀浆或超聲，或(huo)者液氮研磨后加入裂解(jie)液。注意裂(lie)解(jie)液中不能含有Tris，硫脲等含有游(you)离氨基(ji)的試剂。
☆亚細胞器蛋白：匀浆后差速离心或超速离(li)心分离(li)亚細胞器，再用裂解液裂解亚(ya)細胞(bao)器。
☆血浆等含有高峰度蛋白(bai)的樣品：需(xu)提前去除高峰度蛋白(bai)。
蛋白定(ding)量一定要盡(jin)量準確。
☆酶解前用丙酮沉淀去除樣品(pin)中的尿素等變性剂(ji)，再用試剂盒提供的buffer重溶蛋白。
☆標記前標記試剂用50-60ul异(yi)丙醇悬起(qi)，肽段的浓度應该(gai)在2-5ug/ul，肽段溶液的體积與標記試(shi)剂中异丙醇的體积之比(bi)不能高於2：3。
☆標記結束后先用MALDI-TOF檢測標(biao)記的情况，如(ru)果(guo)不好可再加一遍標記試剂
☆確認標(biao)記成功后將各樣品混(hun)合在一起，用SCX分离成10-20個組分。所(suo)用的液相體系為KH2PO4+KCl。
☆用C18再將所有組(zu)分脱盐(yan)、抽干、重溶(rong)。
☆用MALDI檢測(ce)每個組分的肽段組成情况(kuang)，組成接近的或者肽段(duan)含量少的合並到其他組(zu)分中。
iTRAQ標記定量檢測儀器
☆要求儀器精(jing)確度高，可測低(di)質量端。
☆三級四極杆質谱，如ABI 公司的Q Star、Q Trap。
☆QTOF
☆LC-MALDI-TOF
iTRAQ標記定量結果分析：
分析软件：
Wrap-LC, Scaffold Q
分析流程：
質谱原始数據→软件提(ti)取每副質(zhi)谱圖的保留時間、峰強(qiang)度、碎片离子質量信息(xi)→生成(cheng)mjf、xml等格式的文(wen)件→数據库檢索→根據一個或多個unique 肽段的報告离子的強度變(bian)化計算出蛋白(bai)豐度的變化倍数→归一化處理→软件提取搜索結果中(zhong)匹配肽段的保留時間、報告离子的強度等(deng)信息。
iTRAQ技術主要特點：
1、分(fen)离(li)能力強、分析範围廣
2、定性分析結果可(ke)靠，可以同時給出每(mei)一個組分的分子量和豐富的結(jie)構信息 ，MS具備高灵敏度、檢測限低 ，分析時間快，分离效(xiao)果(guo)好 ，自動化程度高
3、TRAQ技術(shu)不仅可发現胞浆蛋白，還有膜(mo)蛋白、核蛋白、胞外(wai)蛋白
4、iTRAQ技術可檢(jian)測出低豐度蛋白(bai)、強碱性蛋(dan)白、小於10KD或大於200KD的(de)蛋白
iTRAQ技術-樣品準備：
蛋白運輸：24小時内可以4度(du)運輸
蛋白长期保存：-20度
待檢測蛋白要求：蛋白(bai)量最(zui)低50ug，浓(nong)度最低(di)要 為5ug/uL 10ul
蛋白提取試剂要求：使(shi)用普通的組織、細胞裂解液即可(ke)，切忌不要(yao)使用(yong)二維電泳試剂提取。
注意事項：
☆客(ke)戶所(suo)提供的待測蛋白量最低要求50ug，浓度最低要為5ug/uL，否則(ze)準確度低。
☆或者您直接提供組(zu)織或細(xi)胞，后續操作全部由我們(men)來做。
☆itraq服務您只需(xu)要提(ti)供樣本，其他試剂都无需提供。
SILAC技術服務
SILAC 的是分(fen)別用天然同位素(su)(轻型)或稳定同位素(重型)標記的必(bi)需氨基酸取代(dai)細胞培养基中相應氨基酸，細胞(bao)經 5-6 個倍增周期后，稳定同位素(su)的氨基酸完全掺入到細胞新合成的蛋白質中替(ti)代了原有氨基酸。不同標記細胞的(de)裂解蛋白按細胞数或蛋(dan)白量等比例混合，經分离、純化后(hou)進行質谱鉴定。
技術優勢
· 该技術(shu)屬於體内標記，標記效果稳定，細胞在傳代6-8代之后，蛋白標記效率可達90%以上(shang)。其標記效率不受裂解液的(de)影響，不仅適合與進行全細胞(bao)蛋白的(de)分析，還適合膜(mo)蛋白的鉴定與定量。
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